La terapia genica del diabete Mellito di tipo 1

Introduzione

La terapia genica si basa sul trasferimento di materiale genetico (DNA o RNA) in vivo (in cellule presenti nell’organismo del paziente) o ex vivo (in cellule temporaneamente isolate dal paziente stesso) allo scopo di prevenire o curare una malattia. Nella maggior parte dei casi, questo tipo di terapia consiste nell’introdurre un gene di interesse in un gruppo specifico di cellule per compensare un difetto genetico, congenito o acquisito, o per aggiungere una proprietà mancante alle cellule bersaglio ^​1​.
Negli ultimi anni la terapia genica sta emergendo come una nuova promettente opzione anche per il trattamento del diabete mellito di tipo 1 (DM1); in questa condizione clinica, come è noto, le beta cellule pancreatiche sono distrutte dal processo auto-immunitario e la capacità secretoria insulinica è compromessa. L’applicazione della terapia genica in questo campo ha permesso a diversi gruppi di produrre evidenze scientifiche nel campo nell’ingegnerizzazione di cellule autologhe non insulari con capacità di sintetizzare e secernere insulina (terapia del gene dell’insulina).

Tre distinti approcci sono stati perseguiti, fino alla data attuale, per lo studio e la prevenzione del Diabete Mellito di tipo 1:

1. l’induzione della produzione e della secrezione di insulina in cellule non naturalmente insulino-secernenti;
2. la generazione di beta-cellule “surrogate” a partire da elementi cellulari non-beta;
3. la prevenzione dell’insulite autoimmune modificando il sistema immunitario.

Induzione della produzione e della secrezione di insulina in cellule non naturalmente insulino-secernenti:

Per queste finalità, l’epatocita è stata la cellula bersaglio più comunemente utilizzata. Questa tipologia cellulare possiede naturalmente le molecole GLUT-2 e glucochinasi, che costituiscono il sistema “gluco-sensorio” in grado di riconoscere ed iniziare a metabolizzare il glucosio. Questo sistema nella beta-cellula pancreatica permette di avviare il processo di secrezione insulinica ed inoltre permette di adeguare la secrezione alle oscillazioni glicemiche dell’organismo ^​2​. L’epatocita, inoltre, è in grado di auto-regolare l’espressione di alcuni geni che codificano per enzimi coinvolti nella glicolisi o nella sintesi degli acidi grassi in risposta alle variazioni della concentrazione di glucosio^​3​. Per queste finalità sono stati avviati esperimenti dove il gene della proinsulina umana è stato inserito all’interno di piccole molecole circolari di DNA, chiamate minicircoli (Figura 1). Questi contengono siti di clivaggio della proinsulina, il promotore dell’albumina, sequenze nucleotidiche responsive al glucosio ed una serie di altri elementi regolatori che aumentano l’efficienza della trascrizione e del processamento dell’mRNA. Gli epatociti trasdotti ex vivo con i minicircoli erano in grado di produrre grandi quantità di insulina umana in maniera glucosio-dipendente. In vivo, ratti resi diabetici con streptozotocina ed inoculati con il nuovo costrutto genico presentavano normali valori glicemici a digiuno o in risposta ai pasti. In esperimenti condotti in modelli murini l’aumento dei livelli di insulina in risposta al glucosio era sufficientemente rapido da correggere l’iperglicemia indotta da un carico intraperitoneale di glucosio nell’arco di 45 minuti ^​4​. Più recentemente, in animali da esperimento (topi CD-1 diabetici), la somministrazione nella vena porta di vettori virali (adenovirus) veicolanti il gene della proinsulina umana ha dimostrato di essere efficace nel il mantenimento della glicemia per oltre un anno. In questo modello murino gli episodi di ipoglicemia erano tuttavia frequenti in corso di digiuno prolungato ^​5​.

Generazione di beta-cellule “surrogate” a partire da elementi cellulari non-beta:

Un altro approccio promettente, che sfrutta i principi della terapia genica, è rappresentato dalla possibilità di trasformare tipi cellulari maturi in altre tipologie, forzando l’espressione di geni chiave per la differenziazione. Alcuni ricercatori hanno provato a generare beta-cellule “surrogate” per sostituire quelle perse a causa dell’insulite autoimmune, come nel DM1. Forzando l’espressione di fattori di trascrizione insulari noti è stato possibile riprogrammare una vasta gamma di tipi cellulari (fra cui cellule del pancreas esocrino, cheratinociti, cellule staminali adipose ed epatociti). In tutti questi modelli è stata dimostrata la capacità di sintetizzare l’insulina e la possibilità di rilascio in maniera glucosio-mediata. In particolare, è stato dimostrato che i fattori di trascrizione PDX1, MafA, NeuroD1, Neurog3, Pax4, Pax6, Nkx6.1, Nkx2.2, potrebbero avere un ruolo nell’acquisizione e nel mantenimento del fenotipo beta-cellulare e questi fattori di trascrizione, in aggiunta al gene dell’insulina, potrebbero facilitare l’acquisizione di un fenotipo sempre più simile alle beta cellule originali ^​6​. Oltre le cellule epatiche, anche le alfa-cellule pancreatiche, secernenti glucagone, sono candidati promettenti per la sostituzione beta-cellulare nell’uomo. Questa popolazione cellulare condivide fasi dello sviluppo embriologico con la cellula beta e potrebbero rappresentare perfetti candidati per terapie geniche mirate. Recentemente, vettori adenovirali contenentui i geni per PDX1 e MafA sono stati infusi attraverso il dotto pancreatico di topi con diabete autoimmune o chimicamente indotto; con questi approcci è stato dimostrato un efficace effetto di riprogrammazione di cellule alfa verso beta cellule funzionanti ^​7​. In tutti i topi pretrattati chimicamente con allossano (agente che distrugge le beta cellule), si è assistito alla normalizzazione della glicemia (di base e dopo carico di glucosio) e ad un aumento della massa beta-cellulare (Figura 2). Nei topi con diabete autoimmune, invece, l’euglicemia era raggiunta in una percentuale variabile di animali in relazione alla precocità del trattamento (Figura 3).

Prevenzione dell’insulite autoimmune modulando il sistema immunitario:

Oltre all’obiettivo specifico che prevede la sostituzione delle beta cellule perse in corso del processo autoimmune, un altro approccio possibile con al terapia genica potrebbe essere quello di modulare il sistema immunitario. Alcuni gruppi di ricerca hanno testato modificazioni genetiche in cellule del sistema immunitario in modelli sperimentali di DM1 allo scopo di prevenire lo sviluppo del processo autoimmunitario che causa la distruzione beta-cellulare negli individui suscettibili. Dal momento che la malattia è sostenuta dalla presenza linfociti T CD4+ autoreattivi che distruggono le beta-cellule pancreatiche, il trapianto autologo di cellule staminali emopoietiche (HSC) è stato recentemente preso in considerazione come opzione terapeutica nelle persone con DM1. È stato dimostrato che le HSC di topi diabetici non obesi (NOD) esprimono bassi livelli di PD-L1, molecola immuno-regolatoria che inibisce i linfociti T attivati contribuendo al mantenimento della tolleranza immunologica ^​8​. HSC geneticamente modificate per sovra-esprimere PD-L1 sono state capaci di inibire la risposta autoimmune in vitro ed indurre in vivo una remissione della malattia nei topi NOD con iperglicemia di recente riscontro. La ridotta espressione di PD-L1 è stata confermata anche in HSC prelevate da persone con DM1. Queste cellule progenitrici, una volta rimodulate farmacologicamente hanno inibito la risposta autoimmune in vitro.

Riassumendo, la terapia genica sta emergendo come promettente alternativa ai regimi convenzionali di trattamento nelle persone con DM1, almeno in modelli murini di studio. Tre distinti approcci sono stati perseguiti allo scopo di prevenire o curare la malattia: 1) l’induzione della produzione e della secrezione di insulina in cellule non naturalmente insulino-secernenti; 2) la generazione di beta-cellule “surrogate” a partire da elementi cellulari non-beta; 3) la prevenzione dell’insulite autoimmune modificando il sistema immunitario. Ciascuno di questi approcci ha mostrato vantaggi e limiti nei modelli preclinici di studio.
Questi approcci non sono ancora disponibili per il trattamento del diabete nell’uomo.